光频谱度胞体超声波的预设和药品勘验的研讨

　　实验材料100N型硅片，1000热氧化法在硅片表面氧化一层30nm厚的SiO2，利用打磨技术将硅片的厚度打磨至100um，并用PDMS（聚二甲基硅氧烷）在芯片表面做培养测量腔，腔体的上表面用光学增透玻璃密封，玻璃表面镀金电极作为参考电极。

　　用多聚鸟胺酸（PolyOrnithine）和层纤维蛋白（Laminin）的混合液（PLOL）在LAPS表面做培养前处理。选择不同浓度的乙酰胆碱作为大脑皮层神经细胞的刺激药物，检测在不同药物不同浓度作用下神经细胞动作电位的相对变化。

　　细胞培养细胞培养是在标准条件下进行的，新生乳鼠（5d7d）于无菌条件下快速断头，剪开颅骨，取下大脑皮层剪碎备用。用PBS（磷酸缓冲液）（pH74，下同）清洗，离心1000rpm3次，弃上清液。加入025胰蛋白酶液（pH7478），在37温箱，消化30min.用吸管反复吹打，形成单细胞悬液后，用200目筛网过滤。再用PBS清洗，离心1000rpm3次，弃上清液，然后用含10gL神经生长因子（NGF）的DMEM培养液将其制备成细胞悬液；将所制细胞悬液分别加到涂过PLOL层的玻片和硅片上。37，5CO2培养。每2天换液一次，每次看情况换适量新鲜培养液；培养第二天加入10gmL的5-氟尿嘧啶的培养液，抑制成纤维细胞生长。培养第四天取玻片和硅片进行镜检和实验。

　　细胞固定实验表明，在人工基底培养细胞，细胞与基底的距离不小于40nm.细胞与硅器件耦合的情况，直接影响测量信号的大小，尤其对于不容易贴壁生长的神经细胞来说，如果细胞与芯片之间的间隙（电解液层）过大，接触电阻会增大，部分电流也会通过溶液泄漏，这些都会直接影响生物信号的检出，在细胞研究中，是一个难点。因此，减小细胞和基底材料之间的过渡涂层间隙，同时增加细胞在表面的附着会对细胞传感器界面设计提供很大的帮助<7>.

　　为了实现这个目的，设计了两种细胞固定的方案：（1）涂敷法，即在芯片表面做增强贴附性的涂层；（2）通过改变芯片表面的粗糙度，做诱导细胞生长的图形。涂敷法过程如下：将100gmL多聚鸟氨酸的磷酸盐缓冲液和8gmL层粘素的磷酸盐缓冲液按11混合，用022m的微孔滤膜滤菌，将器件浸入该混合溶液（PLOL）中，37，5CO2环境下，浸泡24h，再用MilliQ水冲洗两次，冷冻备用。多聚鸟氨酸和层粘素有负电荷，促使细胞紧紧粘附在硅片上，同时还防止了硅片上的SiO2的水合<8>.

　　测量原理由于要测量的是细胞外液体环境的生理参数，所以采用的是具有EIS结构的LAPS系统。它的基本原理是半导体的内光电效应，即当半导体受到一定波长的光照射时，半导体吸收光子，发生禁带到导带的跃迁，即产生电子空穴对。在一般情况下，电子空穴对很快复合，在外电路中是测不到电流的。如果，给LAPS外加反向偏置电压时（N型硅加负压，P型硅加正压），半导体中产生耗尽层，这时靠近耗尽层的电子空穴对就被耗尽层拉开，如（a）所示。当固定光强时，就会产生光电压，这就是光电池的原理。

　　实验装置细胞生长4d后取出先镜检，然后封腔开始测量，为该新型单细胞传感器测量系统框图。HeNe激光器（CoherentCo.）作为光源，波长5435nm，功率5mW.直径为2mm的激光束先通过斩波器，产生频率为4KHz的调制光，当细胞产生动作电位时，LAPS立即可以检测到这种变化，产生相应强度光生电流，并通过工作电极传输到外围设备。通过恒电位电流仪自带的三电极电路检测出该电流并转换成电压，经过前置放大器及模拟滤波器进行信号的放大和预处理，由16位PCI6035数据采集卡和LABVIEW软件控制采集、分析和存储。加药3min后，开始测量单细胞胞外电位的变化情况，LABVIEW可实现同步采样和数字滤波等常规信号处理算法，对信号进行幅值和频率分析。计算机同时也控制蠕动泵的通断、测量腔的温度，营养成分和测量腔都保持恒温在3702。

　　结论单细胞传感器是用于单个细胞电生理以及药物分析等研究的一种非常有价值的手段。在研究的细胞微生理计的基础上，进一步开展了单细胞传感器设计及对于药物作用下细胞电生理的研究，通过单细胞传感器的结构设计、细胞在传感器表面的固定化技术研究以及大量的药物测试实验与分析，得到了药物作用于单细胞的一些定性分析结果和初步实验验证，实验结果与理论分析基本吻合。